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潔凈實驗室生物安全柜得作用及原理

華銳凈化 / 2020-03-09 23:55:41 / 閱讀

1、為避免病原微生物氣溶膠對操作人員和環(huán)境的傳染,實現(xiàn)其間的一次隔離,必須使用微生物安全柜

技術要點

潔凈實驗室中的多種微生物操作都可能產生氣溶膠,如吸管操作、離心沉淀、用接種環(huán)蘸液體、開安瓿、機械震蕩、菌種稀釋或接種操作等,此外,一些實驗操作過程的意外事故,如液體傾灑或飛濺都會產生氣溶膠。散播在空氣中的氣溶膠粒子直徑一般在1~5μm,肉眼無法觀察到,因此實驗室操作人員通常無法意識到操作過程中氣溶膠生成并可能被吸入,或在實驗過程中在工作臺面上造成與其他實驗材料間的交叉污染。資料表明,對276種微生物操作進行測試,其中239種操作可以產生微生物氣溶膠,占全部操作的86.6%。根據(jù)研究,高濃度吹吸混勻以及注射攻毒過程會產生高濃度生物氣溶膠。

正確的使用生物安全柜可以有效地減少由于暴露于氣溶膠所造成的實驗室獲得性感染以及實驗材料間的交叉污染,同時生物安全柜也可起到保護環(huán)境的作用。因此,生物安全柜在微生物實驗室得到廣泛的應用。

 

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生物安全柜分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級,應正確了解使用。

技術要點

生物安全柜分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級,如表2-1所示。

表2-1 生物安全柜分類

 

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Ⅰ級生物安全柜

Ⅰ級生物安全柜原理和實驗室通風櫥一樣,Ⅰ級生物安全柜的工作原理圖見圖3-1。

圖3-1 Ⅰ級生物安全柜原理示意圖

技術要點

1、I級安全柜有前窗操作口,操作者可通過前窗操作口在安全柜內進行操作。前窗操作口向內吸入的負壓氣流可以保護操作人員的安全,排出氣流經高效過濾器過濾后排出安全柜保護環(huán)境。

2、但因未滅菌的房間空氣通過生物安全柜正面的開口處直接吹到工作臺面上,因此Ⅰ級生物安全柜對操作對象不能提供切實可靠的保護,即不能進行需無菌潔凈條件的操作。由于不能保護柜內產品,目前已較少使用。

 

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Ⅱ級生物安全柜

1、Ⅱ級生物安全柜原理

Ⅱ級安全柜有前窗操作口,操作者可以通過前窗操作口在安全柜內進行操作。Ⅱ級安全柜送風經過送風高效過濾器過濾后,從頂部向下形成具有一定速度的垂直單向氣流以避免樣品間的交叉污染,此外,此垂直單向氣流在前窗操作口形成具有一定風速的垂直氣流也可以防止室內未經過濾的空氣直接進入工作臺面,從而保護樣品。前窗操作口向內吸入的負壓氣流可以保護操作人員的安全,氣流經排風高效過濾器過濾后排出安全柜以保護外界環(huán)境。

2、Ⅱ級A1型生物安全柜

Ⅱ級A1型生物安全柜的工作原理如圖3-2所示。它的工作窗口進風氣流和工作區(qū)垂直氣流混合后在內置風機作用下經前后格柵進入安全柜回風道,進而到達安全柜送、排風高效過濾器之間。借助于這兩個濾器相對尺寸的變化,約30%的氣流經排風過濾器過濾后排至實驗室或通過排風管道排至室外;70%的氣流經送風高效過濾器過濾后重新循環(huán)進入安全柜工作區(qū)。

Ⅱ級A1型生物安全柜的污染部位有正壓區(qū)域。

圖3-2 Ⅱ級A1型生物安全柜原理示意圖

3、Ⅱ級A2型生物安全柜

Ⅱ級A2型生物安全柜的工作原理如圖3-3所示。Ⅱ級A2型生物安全柜是由Ⅱ級A1型生物安全柜的發(fā)展而來,其也是利用70%的循環(huán)空氣,30%經排風高效過濾器過濾后排至外部環(huán)境。

圖3-3 Ⅱ級A2型臺式生物安全柜氣流流向狀況示意圖(據(jù)美國CDC手冊)

4、Ⅱ級B型生物安全柜

Ⅱ級B型生物安全柜又分為B1型和B2型兩種。其中Ⅱ級B1型生物安全柜也為非全排型生物安全柜,但相比于Ⅱ級A型生物安全柜,其循環(huán)風比例減少到30%,且安全柜內所有污染部位均為負壓區(qū)域或者被負壓區(qū)域包圍,即沒有正壓污染區(qū)。Ⅱ級B1型生物安全柜工作原理圖見圖3-4。

圖3-4 Ⅱ級B1型生物安全柜原理示意圖

Ⅱ級B2型生物安全柜是一種全排式生物安全柜,其工作原理圖見圖3-5,其沒有氣流在柜內循環(huán)。這種安全柜能提供基本的生物和化學防護,但有些化學物質在安全柜內操作時能損壞過濾器介質、框架、墊圈導致泄漏,應多加注意。送風機裝在安全柜的頂部一側,從室內抽吸空氣,通過送風高效過濾器下行到工作區(qū),所有進入柜內的氣體都經過格柵被排出。排風經過安全柜頂部另一側設置的排風高效過濾器過濾后排放至室外或者排風總管內。

圖3-5 Ⅱ級B2型生物安全柜示意圖(據(jù)美國CDC手冊)

技術要點

 

1、Ⅱ級生物安全柜原理

(1)Ⅱ級生物安全柜不僅能提供人員保護,而且能保護工作臺面的物品以及環(huán)境不受污染。二級生物安全柜是目前應用最為廣泛的柜型。

(2)Ⅱ級生物安全柜在美國的NFS 49標準中有兩種不同的類型。根據(jù)排風的比例分別為A型和B型,A型又根據(jù)有無排風管路分為A1型和A2型,B型分為B1型和B2型,而在歐洲的EN12469標準中是不分型的。由于美國的生物安全柜進入國內較早,因而國內的生產企業(yè)仿制或研究生產的Ⅱ級生物安全柜均依靠美國標準進行分型。

2、Ⅱ級A1型生物安全柜

如圖3-2所示,Ⅱ級A1型生物安全柜的污染部位有正壓區(qū)域,即風機后側的回風道中的空氣是污染的,而且空氣是正壓,正壓污染區(qū)內的污染有外泄的可能。

3、Ⅱ級A2型生物安全柜

和Ⅱ級A1型生物安全柜不同的是,Ⅱ級A2型生物安全柜內所有污染部位均為負壓區(qū)域或者被負壓區(qū)域包圍,即Ⅱ級A2型生物安全柜的回風道始終處于負壓狀態(tài),其安全性高于Ⅱ級A1型。

4、Ⅱ級B型生物安全柜

(1)Ⅱ級B2型生物安全柜一般在排風管另一端單獨設置排風機以保證排風管道負壓。

(2)一般Ⅱ級B2型生物安全柜無循環(huán)風,其排風量較大,因而在配有Ⅱ級B2型生物安全柜的實驗室或房間需要考慮補風問題。

(3)由于Ⅱ級B2型生物安全柜可以處理更危險的病原體和化學物質,所以其排風要求必須排至室外,排風管道采用密閉式連接,并且為負壓管道。

 

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Ⅲ級生物安全柜

三級生物安全柜是為4級生物安全設計的,Ⅲ級安全柜是柜體全封閉、不泄漏結構的負壓通風柜,工作人員通過連接在實驗室柜體的手套進行操作,俗稱手套箱(Golve box),試驗品通過雙門的傳遞箱進出安全柜以確保不受污染,適用于高風險的生物試驗。

Ⅲ級安全柜工作原理圖見圖5-1。人員通過與柜體密閉連接的手套在安全柜內實施操作。下降氣流經送風高效過濾器過濾后進入安全柜內用以保護安全柜內實驗物品,排出氣流經兩道排風高效過濾器過濾或通過一道高效過濾器過濾再經焚燒處理后外排用于保護環(huán)境。

技術要點

1、Ⅲ級安全柜的箱體采用氣密性設計,柜體外設置專門的排風系統(tǒng)以維持安全柜內不低于120Pa的負壓狀態(tài)(相對于實驗室);

2、同時要保證單只手套意外脫落后手套口有不低于0.7m/s的吸入氣流速度;

3、Ⅲ級安全柜進出物品均需經過傳遞窗或者經特殊設計的自封閉型傳遞桶;

4、Ⅲ級生物安全柜可以最高程度的保護操作人員和外部環(huán)境,同時兼顧保護安全柜內實驗物品,Ⅲ級安全柜適用于操作危險度4級的病原微生物或感染動物。

圖5-1 Ⅲ級生物安全柜(手套箱)示意圖

 

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生物安全柜的性能指標、驗證方法及相關標準

1、生物安全柜的性能指標

生物安全柜是保護人員、產品和環(huán)境暴露于微生物污染的一級隔離屏障。生物安全柜送、排風氣流的平衡、操作臺面上的氣流分布和生物安全柜的完整性是生物安全柜性能有效性的重要保障。因此其性能指標的規(guī)定及驗證也主要圍繞以上這三個方面。這些指標及相應要求可直接引用標準JG 170-2005《生物安全柜》、YY 0569-2011《Ⅱ級生物安全柜》的相關要求,包括生物安全柜的垂直下降氣流平均風速、工作窗口氣流平均風速、氣流流向(垂直氣流、觀察窗隔離效果氣流、工作窗口及其邊緣氣流)、操作面空氣潔凈度、人員安全性、受試樣品安全性、交叉感染、箱體檢漏、送風高效過濾器完整性、排風高效過濾器完整性,對于Ⅲ級生物安全柜其設計形式區(qū)別于Ⅰ、Ⅱ級生物安全柜,Ⅲ級生物安全柜指標還包括安全柜箱體內外靜壓差、箱體嚴密性及安全柜手套口氣流流向等。還有一些指標如安全柜運行噪聲、操作臺面照度是考慮操作人員本身舒適性;生物安全柜的安裝位置主要是考慮維修時的便利性。

2、主要性能指標的測試方法

(1)垂直氣流平均風速:在距離內側壁板及工作窗100mm圍成的,工作臺面上方300mm處的平面區(qū)域內測量垂直氣流的平均風速。測量點按行、列均為150mm的網格分布。若去除測量邊界后凈尺寸不等于15的整數(shù)倍,則允許修正測量點距離,但每列至少測量3點,每行至少測量7點。垂直氣流平均風速為各測量點讀數(shù)的算術平均值。具體的指標要求可參照標準JG 170-2005《生物安全柜》、YY 0569-2011《Ⅱ級生物安全柜》的相關要求。

(2)工作窗口氣流平均速度:常用的測試方法主要有兩種:風量罩檢測法、風速儀檢測法。

(3)Ⅲ級生物安全柜手套口處的風速:手套口風速是通過人為摘除Ⅲ級生物安全柜一只手套后,將風速儀探頭放在手套口的中心處,并記錄測量點的風速。測試之前,要保證生物安全柜已達到正常運行狀態(tài),且生物安全柜的嚴密性、靜壓差及送風量應均已通過檢測,并符合相關標準要求。

(4)氣流流向:氣流流向測試時,采用發(fā)煙管發(fā)生可視煙霧,通過觀察煙霧流向來驗證生物安全柜的氣流流向。氣流流向包括垂直氣流流向、觀察窗隔離效果氣流流向、工作窗口邊緣氣流流向和工作窗開口氣流流向。

(5)靜壓差:Ⅲ級生物安全柜與所在房間的相對壓差可用微壓差計直接測量。測試時,Ⅲ級生物安全柜應已達到正常運行狀態(tài),用微壓差計分別連接Ⅲ級生物安全柜內部及實驗室環(huán)境便可直接測出Ⅲ級生物安全柜的靜壓差。Ⅲ級生物安全柜與所在房間之間的負壓值應不低于120Pa。

(6)潔凈度:采用激光粒子計數(shù)器在生物安全柜操作面內按要求布置的測點上測量空氣的含塵濃度。

(7)噪聲:生物安全柜正常運行時,采用聲級計在被測生物安全柜前壁面中心水平向外300mm,高度距工作臺面380mm處測量。

(8)照度:在操作面上,沿操作面內壁面水平中心線每隔300mm設置一個測量點,與內壁距離小于150mm時,不再設置。被測生物安全柜置于正常工作條件下,用照度計檢測各測量點。被測生物安全柜照度為各測量點照度的算術平均值。

(9)高效過濾器完好性檢測:排風高效過濾器作為生物安全柜的最重要的防護屏障之一,是防止有害生物氣溶膠排放至大氣的最有效防護手段。因此,我國標準GB 50346-2011《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》要求必須對三級和四級生物安全實驗室內使用的隔離設備的排風高效過濾器進行原位檢漏;而送風高效過濾器是生物安全柜內部潔凈度的重要保障。

而確定高效過濾器是否有縫隙、孔眼而發(fā)生漏泄,是否完好無損。通常高效過濾器采用物理氣溶膠進行完好性檢測,高效過濾器的檢漏方法根據(jù)檢測方式不同主要分為掃描法檢漏和全效率法檢漏。

(10)Ⅲ級生物安全柜箱體嚴密性檢測:標準ISO 10648-2:1994對硬質隔離器的嚴密性進行了等級劃分,共劃定了4個等級,1 級最高,4級最低。目前Ⅲ級生物安全柜箱體嚴密性指標可采用ISO 10648-2:1994中的2級密封箱室(長期從事含有有害氣體的防護箱室)的期間檢驗指標,即箱體內壓力低于周邊環(huán)境壓力250Pa下的小時泄漏率不大于凈容積的0.25%。根據(jù)2級密封等級,按標準ISO10648-2:1994要求應采用壓力衰減法進行測試。

(11) 泄漏電流、接地電阻、耐電壓、絕緣電阻

泄漏電流測試時,讓生物安全柜連續(xù)運行4h后,施加110%額定電壓,用泄漏電流測量儀測量機組外露的金屬部分與電源線之間的泄漏電流;接地電阻測試時,將被測生物安全柜所有的功能開關均置于“斷”位,用接地電阻測試儀測量接地端與可觸及的金屬部件之間的電阻值;耐電壓測試時,電氣強度測試歷時1min,經受頻率為50Hz的基本正弦波的交流電壓,測試的部位為電源輸人端與金屬外殼之間。最初施加的電壓不超過規(guī)定值的一半,然后迅速上升到規(guī)定值,試驗期間不應發(fā)生擊穿;絕緣電阻測試時,在施加500V直流電壓1min后進行絕緣電阻測量,在帶電部件與殼體之間值應不小于2MΩ。

(12)振動幅值及工作臺面抗變形

為判斷使用者在操作生物安全柜時的振動結果,振動值應達到要求的機械性能,以此減輕操作者的疲勞并預防振動導致精密組織培養(yǎng)試驗品的破壞。被測生物安全柜置于正常工作條件。將振動儀的振動傳感器牢固地固定在工作臺面的中心,振動儀的頻率從10Hz變化到10kHz,測量生物安全柜工作時的總振幅。

工作臺面抗變形試驗時,將面積為250mm×250mm、重量為23kg的測試負載均勻地施加于被測生物安全柜臺面中央,在載重條件下測量安全柜臺面前部邊緣中心至地面的距離。

負載及空載條件下安全柜臺面前部邊緣中心至地板的距離相等,可視為臺面無永久性變形。

(13)紫外燈測試

對于設置紫外燈的生物安全柜,必須對紫外燈定期檢查,以保證其能有效地殺死微生物。在將燈關閉冷卻后,要用70%的酒精擦拭燈泡表面。將其打開5min后,將紫外線感應器放置于工作表面中心,照射的光在254nm波長處不應少于40mW/cm2。

技術要點

1、生物安全柜的性能指標

(1)生物安全柜的指標中人員安全性、受試樣品安全性和交叉感染驗證需采用生物學方法驗證,生物學檢測驗證的目的是為了保證生物安全柜在使用中的安全性,這種驗證方法可以貼近真實的直接驗證安全柜的實際使用性能。其中對操作人員的保護驗證,是為防止試驗操作過程中產生的感染性微生物氣溶膠對工作人員的威脅;對試驗操作樣品的保護驗證,是為防止生物安全柜以外的污染物進入安全柜,對試驗樣品造成污染;交叉感染驗證,是為防止試驗操作過程中產生的生物氣溶膠造成試驗樣品間的交叉污染;

(2)Ⅰ級生物安全柜不提供產品保護,工作面氣流為亂流,只進行人員保護試驗一項檢測;

(3)Ⅱ級生物安全柜需進行人員、樣品、交叉污染保護三項檢測;Ⅲ級安全柜前部封閉,工作面氣流為定向氣流,有局部的亂流,不需要進行人員、樣品保護和交叉污染試驗;

此外,生物安全柜還有一些其他性能指標主要是為了檢查安全柜的設計結構性能、電路和物理性能等,包括振動幅值、柜體抗變形、工作臺面抗變形、柜體穩(wěn)定性、溫升、泄漏電流、接地電阻、耐電壓、絕緣電阻、報警和連鎖系統(tǒng)、紫外燈性能等。

2、工作窗口氣流平均速度測量方法

(1)風量罩檢測法是采用風量罩測出工作窗口風量,再通過風量除以工作窗口面積計算出氣流平均風速,測量時將風量罩密封在安全柜的前窗操作口中心,風量罩兩側開口區(qū)域要密封;

(2)風速儀檢測法是采用風速儀直接測量工作窗口斷面風速,測量時,將工作窗開口高度開到指定的操作高度。用風速儀在工作窗開口平面直接測量風速。測點的水平間隔為100mm,垂直方向分別距工作窗口上邊緣1/4工作窗口高度處和3/4工作窗口高度處,測點的平均值即為工作窗口氣流平均速度。

3、氣流流向

(1)垂直氣流驗證時,在II級生物安全柜工作表面中線上方高于工作窗口上沿100mm處,從可移動垂直窗一端到另一端發(fā)煙,垂直氣流方向煙霧應為垂直氣流線,且無死角和回流;

(2)觀察窗隔離效果氣流驗證時,在Ⅰ級、Ⅱ級生物安全柜觀察窗內25mm處,在工作窗口上邊緣150mm處,從生物柜的一端向另一端發(fā)煙,氣流流向應為垂直氣流線,不得有死角和回流;

(3)工作窗口邊緣氣流驗證時,在Ⅰ級、Ⅱ級生物安全柜外38mm處,讓煙霧沿著工作窗開口的整個邊界擴散,煙霧應進入安全柜內部無外逸,且無穿越工作區(qū)氣流;

(4)工作窗開口氣流流向驗證時,在I級、II級生物安全柜內部,工作面上300mm,距工作窗口內壁50mm到柜后側內壁整個水平面上發(fā)煙,煙霧測試時應無煙霧從窗口外逸。

4、潔凈度測量

(1)應根據(jù)生物安全柜操作面的面積確定采樣點數(shù)目,并均勻布點。

(2)I級、II級生物安全柜內部潔凈度要達到5級,Ⅲ級生物安全柜當操作需要保護的受試樣本時,潔凈度也要求達到5級。

5、高效過濾器完好性檢測

(1)掃描檢測法是通過采樣探頭在過濾器下游表面2~3cm位置處沿過濾器的所有表面及過濾器與裝置的連接處如邊框等位置,以一定的速度移動測試局部區(qū)域的過濾效率,判斷過濾器是否發(fā)生泄漏。掃描法檢漏根據(jù)檢測儀器的測試原理不同分為光度計掃描法和計數(shù)掃描法。

①光度計掃描法檢測氣溶膠常用“冷發(fā)生”方式,即將一定壓力壓縮空氣通入噴嘴產生多分散油性氣溶膠,如聚α烯烴(PAO)、癸二酸二辛酯(DOS)、癸二酸二酯(DESH)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、石蠟油、殼牌安定來礦物油等。然后通過掃描采樣頭在過濾器表面線性掃描并配合氣溶膠光度計測試各掃描點局部透過率,根據(jù)局部透過率限值判斷漏孔。

②計數(shù)掃描法:氣溶膠物質較廣泛,除可選用上述氣溶膠外,還可以選擇PSL小球或大氣塵等非油性氣溶膠。掃描測試過程類似,測試儀器是粒子計數(shù)器,通過測試上、下游粒子數(shù)濃度,并根據(jù)相應透過率限值或下游粒子數(shù)限值來判定泄漏。

(2)對于無法采用掃描法檢漏的高效過濾器,需采用全效率法檢漏方式,即通過測試過濾器的整體效率來檢漏。全效率法檢漏時在過濾器上游注入氣溶膠,在上游和下游分別進行采樣,上、下游采樣必須經過氣溶膠均勻性驗證,然后根據(jù)上、下游氣溶膠濃度計算過濾器的整體透過率,并與規(guī)定的整體泄漏限值比較來判斷泄漏,根據(jù)使用檢測儀器的測試原理不同也分為光度計全效率法檢漏和計數(shù)器全效率法檢漏。

6、Ⅲ級生物安全柜箱體嚴密性檢測

(1)壓力衰減法的原理是在被測設備體積不變情況下利用被測設備內壓力的衰減變化測試泄漏率。

(2)由于密閉式隔離器普遍安裝有供人員操作的橡膠手套(部分安裝有半身式防護服),因為手套或半身式防護服柔軟富有彈性,導致動物隔離器在不同壓力下,其凈容積會產生變化。而采用壓力衰減法的前提條件就是要保證被測設備內部容積保持不變,因此在使用壓力衰減法測試時應采取必要措施固定手套或半身式防護服以防止其體積發(fā)生較大變化。

(3)同時,也應采取必要措施防止其因壓力過大或作用時間過長造成應力損壞。

 

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生物安全柜現(xiàn)場驗證與風險評估

國外學者Pike對3921例實驗室相關感染進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),不明原因的實驗室感染只占18%,不明原因的感染占到了82%。經過近年來的研究認為其中65%的不明原因感染是因為病原微生物形成感染性氣溶膠隨空氣擴散,實驗室工作人員吸入了污染的空氣感染的。實驗室中,許多操作都可以產生氣溶膠,有人對239種操作進行了測試,其中239種操作可以產生氣溶膠,占86.6%。在實驗室中,像攪拌、振蕩、撞擊、離心、超聲波破碎、接種等都可產生氣溶膠[6]。

生物安全柜是一種為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時,用來保護操作者本人、實驗材料、實驗室環(huán)境及室外環(huán)境,使其避免暴露于上述實驗操作過程中可能產生的感染性生物氣溶膠和濺出物而設計的重要的一級屏障隔離設備。其主要是通過柜體和氣流形成的物理隔離來保護操作者本人、實驗材料、實驗室環(huán)境及室外環(huán)境。

 
標簽:實驗室裝修潔凈實驗室凈化實驗室生物安全柜
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